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怎样做悬浮性细胞的免疫萤光染色?显微镜百科！

请问大家一个问题.
假若养悬浮性的细胞 (例如自然杀手细胞,NK cell)
如何把这样的悬浮性细胞固定在cover slip上之后,然后做IF(免疫染色)

奇怪的是:

1. 细胞都会ㄧ团,然后在显微镜下看都没有焦距
2. 背景有点髒 (有点红或有点绿)
3. 细胞内的目标物都看不到 (我们是在看Perforin)

不晓得根据以上的步骤,可能会是什么原因呢?

以及,不知道大家都怎么做悬浮性细胞的IF呢?(都是:贴附-固定-染色吗?)

北京上光仪器：
我们有试过将NK cell贴在poly-lysine coated cover slip (BD)

直接把NK cell加在poly-lysine coated cover slip上,5小时

然后细胞的确会黏上去 (但会ㄧ团一团)

之后照以下步骤去做IF,如下:

1. 用prewarmed PBS洗2次
2. 以3.7% Formalin固定15min
3. 以PBS (含0.2% Triton X-100)打洞,5min x 3次
4. 以blocking buffer (PBS+5% BSA)室温blocking 1hr
5. 1抗 (1:50 diluted in blocking buffer),室温1-2hr (或 4度C overnight)
6. 以PBS洗,5min x 3次
7. 2抗 (Cy3-labeled anti-rabbit IgG, 1:100稀释),室温45min-1hr
8. 以PBS洗,5min x 3次
9. 然后以正立萤光显微镜观察