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细菌质粒的制备和分析实验细菌质粒
所属分类：显微镜百科 点击次数：615 发布日期：2022-06-20
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细菌质粒的制备和分析实验细菌质粒细菌质粒的制备和分析实验细菌质粒的制备和分析 质粒是存在于染色体外的能独立复制的共价闭合环状双链DNA分子，它广泛存在于细菌等原核生物中，能够给宿主细胞提供一些表型，如抗药性、分解复杂有机物的能力等。天然质粒经过改造后可以作为基因工程的载体，这种质粒载体在基因工程中具有极广泛的应用价值。因此质粒的分离与提取是分子生物学最常用、最基本的实验技术之一。 细菌质粒是最常用的基因工程载体，它的提取可以分为以下三步：细菌的培养、菌体的收集和裂解、质粒DNA的纯化。细菌的培养通常在选择性的液体培养基中(如含某种适当浓度的抗生素)接种一种含有质粒的宿主菌，37℃、150～250r／min摇培过夜获得。对于某些松弛型复制的质粒，可以在细菌生长的对数后期加入适量氯霉素抑制宿主菌染色体DNA的复制和蛋白质合成来增加质粒拷贝数。但目前所用的质粒载体，如pUC系列，采用强的改进型pMBl复制子，拷贝数能达到几百个，因此不用进行后期的氯霉素处理即可获得高产量的质粒。细菌的收集可以采用离心的方法，为了防止细菌的代谢产物影响质粒的纯度可以用液体培养基或生理盐水漂洗细菌沉淀1～2次。细胞裂解的方法很多，如去污剂法、煮沸法、碱变性法等。这些方法各有利弊，要根据质粒的性质、宿主菌的特性及后续的纯化方法等多种因素加以选择。为了满足一些实验的要求，粗提的质粒还需要进一步纯化，用氯化铯一溴化乙锭密度梯度超速离心纯化质粒DNA是经典的方法。
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