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植物病毒诊断之酵素连结抗体法!显微镜-金相显微镜专卖!
所属分类:显微镜百科 点击次数:363 发布日期:2022-06-20
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酵素连结抗体法(ELISA=Enzyme linked immunosorbent assay):首先将抗血清中之主要抗体 IgG 纯化出来,利用戊二醛本身所具的醛基容易和氨基发生连结的性质形成酵素连结抗体,或利用过碘酸钠先将含有五碳糖酵素氧化形成醛基后再和抗体的氨基连接形成酵素连结抗体,或将纯化后的抗体 IgG 先以胃蛋白酵素分解去除抗体 Fc 非特异附着部位后,所得抗体(Fab’)2片段所持有的-SH 基,再利用马来醯亚胺或二硫化吡啶基和含有-SH 基的酵素连结而得到酵素连结抗体。利用 ELISA 诊断有许多检查的方法,在侦测已未经纯化之材料为被检体时,常用的基本检查法是双抗体包夹法(Double antibodysandwich ELISA)最为普遍,其检查过程简述如下:1 首先将已知抗体吸附在 96 穴检查盘37 ℃下反应 1-2 hr 或室温反应 4-6 小时或 4 ℃下隔夜↓2以洗涤液洗涤后↓3各穴放入各种被检体,37 ℃下反应 1-2 hr 或室温反应 4-6 小时或 4 ℃下隔夜↓4再以洗涤液洗涤↓5各穴加入稀释后的酵素连结抗体,37 ℃下反应 1-2 hr 或室温反应 4-6 小时或 4 ℃下隔夜↓6再以洗涤液洗涤↓7加入酵素基质,室温下反应 15-60 分钟↓反应完全后,加入 3 N 的 NaOH 溶液停止反应若被检体内有抗原(病原)存在,虽然以肉眼无法观察到的微弱抗体抗原反应发生,由于抗体上连有酵素,而酵素遇到其基质则会反应呈色的原理,也就容易用肉眼从酵素的呈色而得知有抗原(病原)的存在。上述过程中之酵素连结抗体,係连结在一次抗体上,若连结在二次抗体(即以兔子免疫注射而来之抗体为抗原,再免疫注射至不同动物如羊所产生之抗体谓之二次抗体)上,则所得之酵素连结抗体,以后检查时只要是由兔子而来之不同种类抗血清,该连结抗体皆可共用。需要检查的病毒种类多时较方便,有人称之谓 IndirectELISA,惟灵敏度及特异性反应较连结在一次抗体的 Direct ELISA 为低。
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