网站网友点击量更高的文献目录排行榜： 点此链接 0 基因植入动物细胞技术 此处紧介绍最常用的方法, 并以组织培养之单层细胞为标的. 组织培养动物细胞, 应注意无菌技术, 为求初学者溶液着手, 以Hela细胞, 即可高温高压消毒的MEM培养液开始, 加入10﹪的牛血清. 并加入Gentamicin sulfate(抗生素), 以防污染. 在细胞剥离培养器时, 採用0.5﹪w/v的trypsin即0.2﹪w/v的EDTA液, 所有的培养液, 在使用前, 必须先抽出少量, 先在CO2恆温培养相中培养至少2天, 无污染出现, 才能使用. 在从事基因植入动物细胞技术前, 应先熟悉动物组织培养, 即生长曲线为必要之练习. 每4小时, 由12圆隔培养盘中, 取出一隔之细胞计数, 至72小时为止. 藉此练习来熟悉无菌即培养技术. 以Calcium Phosphate沉淀DNA于HEPES缓冲液中并使DNA植入动物细胞法： 材    料： 生长期Hela细胞 培养液 质体DNA(含能在动物细胞中表现之可探测基因)(每次转植需10~50μg DNA) 2.5M CaCl2 2x HEPES-buffered saline (Hebs) [配方]16.4g NaCl 11.9g HEPES acid 0.21g Na2HPO4 800ml dH2O 以5N NaOH调整pH至7.05 以0.45μm滤膜过滤消毒, 分别用50ml量保存在-20℃ 注意：此时必须将0.5ml之2xHeBS与0.5ml之250mM CaCl2溷合, 看有否沉淀发生, 如无很细的沉淀, 则效果不佳. Phosphate-buffered saline (PBS) [配方]  10X保存液配方： 80g NaCl 2g KCl 11.5g Na2HPO4 7H2O 2g KH2PO4 1X的使用液配方：   (pH约为7.3) 137mM NaCl 2.7mM KCl 4.3mM Na2HPO4 7H2O 1.4mM KH2PO4 37℃, 5﹪CO2恆温培养箱 10cm组织培养皿 15ml无菌conical tube 方    法： 1.     在转植前一日, 将细胞接种入培养皿, 约1：15比率稀释完全满佈的细胞, 加入9ml培养液. 2.     将要转值得DNA, 以酒精沉淀, 并晾乾, 再溶入450μl的无菌蒸馏水中, 再加入50μl之2.5M CaCl2. (此处以酒精沉淀DNA的目的在消毒) 3.     在一个15ml的conical tube中加入500μl的2X HeBS, 此时一面以一个无菌1μl吸管向此液中打气, 一面一滴滴的加入DNA/CaCl液, 加完后立即votex 5秒钟. 4.     置室温20min. 5.     将此DNA沉淀液均匀分布在组织培养皿之细胞上. 6.     培养6小时, 倒去培养液, 以5ml之1X PBS洗细胞2次, 再加入10ml培养液. 7.     若为暂时性的转植, 隔日即可取下检测. 若为培养稳定之转植细胞, 则令细胞长二次分裂的时间, 在保存之. 预期结果：约10﹪的细胞可被转植. 附注： 为能侦测基因有否植入细胞, "可探测基因"如β-galactosidase, 或萤火虫之luciferase基因均可使用. 在此之前, 本手册层介绍将基因转植入细菌的方法, 当时所使用的为快速简易法, 但基因植入的成功率极低, 此外也已介绍CaCl2法, 在此一并将使用CaCl2来转植细菌的方法列出, 供参考： 材    料： LB培养液 E.Coli纯菌 CaCl2液 [配方]60mM CaCl2 15﹪glyerol 10mM PIPES, pH7.0 (如无PIPES, 则取上二种材料配製) 可高温高压消毒. LB培养皿含ampicillin Plasmid DNA 方    法： 1.     将此菌E.Coli接种于50ml LB液中, 过夜37℃, (250rpm)振盪培养. 2.     取上述E.Coli 4ml, 加入有400ml LB液之1 liter锥瓶, 37℃, 250rpm, 培养6小时. 3.     将(2)中的E.Coli分装在离心管中, 每支50ml, 并置冰上10min, 再离心5,000rpm, 5分钟, 4℃. 4.     将细菌沉淀再溶于10ml, CaCl2液中, 再于4℃, 5,000rpm, 5min. 5.     再将细菌沉淀溶于10ml CaCl2液中, 置冰上30min, 再4℃, 离心5,000rpm, 5min. 6.     再将E.Coli溶于2ml CaCl2液中, 再分成250μl至微量离管中. 并保存在-70℃, 待用. 7.     取一支圆底离心管, 置冰上,加入10至25μl之plasmis DNA约10ng, 取出冷冻于-70℃的细菌, 快速在37℃解冻, 取出100μl加入含DNA的离心管中. 置冰上, 10min. 8.     将此离心管转投入42℃水溶中, 2min, 加入1ml之LB液, 再放37℃, 250rpm, 1hr. 9.     将此转植过的细菌, 稀释数次, 每次以玻棒涂平盘法涂在恆温培养箱, 至第二日检视结果. 关注页面底部公众号，开通以下权限： 一、获得问题咨询权限。 二、获得工程师维修技术指导。 三、获得软件工程师在线指导 toupview,imageview,OLD-SG等软件技术支持。 四、请使用微信扫描首页底部官方账号！