网站网友点击量更高的文献目录排行榜： 点此链接 0 用于修饰DNA的酶与使用方法酶应保存在-20℃冷柜中, 使用时取出放在0℃冰上, 酶的价格昂贵, 宜珍惜使用.各种酶均有其特别的缓冲液. 通常均可在採购时向厂商索取.     The Klenow fragment：是E.Coli DNA PolymeraseI靠C端的部份，为删去由NH2端的323个胺基酸而成，具有DNA Polymerase与3'→5'exonuclease的功能. 以Klenow fragment来将含萤光标定的d NTP或放射性标定的d NTP加于DNA片段尾端, 可将约0.1~4μg由电泳中提纯的DNA, 加上萤光标定的d NTP, 再加上未标定的3 d NTPs, 再加上1U的Klenow fragment, 再加入适量buffer, 置30℃, 20min即可(其中d NTP的浓度在0.5mM). 此原理是利用限制酶切割后再经电泳提纯的DNA, 在二端均有 ----____单股部分, Klenow fragment会将d NTP加于单股处, 此时需注意的是所缺的单股若正好无可配标定d NTP的核甘酸则无法标定, 故应注意. 如以Ban HI切割的会有GATC排序, 若以Eco RI切割的则会有AATT排序, 此时若以有标定的GTP或CTP来标定则无效.     亦可採用Random Oligonucleotide-Primed synthesis方法来标定DNA, 其原理为：将DNA以某一限制酶切割, 再电泳, 取出所需的DNA片段, 加热使此双股DNA分为单股, 再将Random Oligonucleotide(通常为六个nucleotides)接上去, 再放入d NTPs即Klenow frament, 如此, 则DNA片段就会被标定了. 方    法： 1.     在一个小型离心管中加入2.5μl之0.5mM 3dCTPs. 2.     再加入10X之Klenow fragment buffer, 2.5μl. 3.     加入欲标定之有标定dNTP, 1μl. 4.     再加入1μl之Klenow fragment. 5.     再以另一支离心管, 加入约0.03~0.1μg的DNA(想被标定的DNA), 及Random hexanucleotide(1μg), 再加入T.E. buffer使总体机为18μl, 将此离心管置沸水中3min, 再取出放冰上. 6.     将二支离心管物溷合, 置室温, 3hr, 反应即完成. Taq DNA Polymerase之使用：     此酶係由Thermus aquaticus菌所分离出来, 它的最有效温度是在75~80℃, 它多被用于Polymerase Chain Reaction(PCR). 其使用方法在介绍PCR时再行介绍.     RNase亦有由不同来源分离出来者, 所切割RNA的位置亦不同, 但一般RNase均能在多种反应情况下产生作用, 且使用后若要除去它, 通常要加入Proteinase K, 再以Phenol extractions及ethanol precipitation处理. DNA ligases：     用以接合单股有缺口的DNA或双股可交叉配合的DNA(即以限制酶切割所形成的 ----____ 交叉片段. 时下使用的ligase, 要ATP, E.Coli ligase要NAD为能源. 使用方法： 1.     在微量离心管中加入ligase缓冲液,再加入0.5mM ATP, 1μg DNA(即所需接合的DNA), 再加入1μ的T4 ligase, 置15℃, 2hr, 可成. 2.     若係二段钝端DNA接合(即无交叉片段之DNA), 则需10倍以上的酶方能达成. 有研究显示加入即为量的PEG8000可助ligase的功能. 运用ligase构建嫁接DNA分子： 1.     再将想构建的DNA片段经电泳幼提纯之后, 以下法进行： 2.     取0.1至5μg想接合构建的DNA放入微量离心管中(体积以9μl为准), 再加入10μl之2X ligase buffer, 再加入1μl之10mM ATP, 再加入20至500μ的T4 DNA ligase(以有交叉配对的DNA为准). 3.     置15℃, 3hr, 或隔夜, 可成. 4.     将此接合之嫁接媒介, 以基因转植方式, 植入E.Coli宿主, 并检查结果, 依marker表现情形可知有无正确的结果, 若有, 则将含此正确嫁接媒介的E.Coli加以培养, 再以提纯质体方式获取大量所要的嫁接媒介. 2X T4 DNA ligase buffer之配方为： 100mM Tris.Cl, pH7.5  20Mm MgCl2  20Mm DTT(dithiothreitol此物必须冷冻保存)     在构建嫁接媒介时, 必须考虑到它要能在宿主中能自行複製, 且能将所要的基因表现出来, 而且还能加上marker, 以便由marker之有无来检测构建之成功与否. 在使用ligase时, 常会有各种机率的结合, 而产生非所要的结果,亦有多段结合者， 但因皆与或然率有关, 理论上仍会出现若干所要的结果. 关注页面底部公众号，开通以下权限： 一、获得问题咨询权限。 二、获得工程师维修技术指导。 三、获得软件工程师在线指导 toupview,imageview,OLD-SG等软件技术支持。 四、请使用微信扫描首页底部官方账号！