网站网友点击量更高的文献目录排行榜： 点此链接 0 湿度固定、空气成分含百分之五之二氧化碳（5%CO2/95% Air）培养箱。每两天替换新鲜10％FBS之DMEM/F12，培养细胞至第九天进行实验。 二、初级细胞的初代培养(Primarymixglialculture) 以麻醉剂pentobarbital将出生1天之鼠牺牲后，将其大脑 皮质组织置于内含penicillin-streptomycine、fungizone及 HBSS配置成的solutionD中，清除血管与残馀软脑膜后以机 械方式绞碎。将脑组织浸泡在细胞培养液及0.25%胰蛋白脢 消化液（Trypsin-EDTA）中，在37℃水浴槽静置5分钟待细 胞沉淀，去除上清液，加入含有10％FBS(FetalBovineSerum) DMEMF-12培养液，离心(2000rpm)10分钟。去除上清液， 加入新的细胞培养液并以电动吸管（Pipet）反覆吸放数次， 溷合均匀，以纱布过滤不要的组织块。细胞悬浮液以血球计 数器计算细胞数，再分种于预先舖有poly-L-lysine（0.02g/L） 。处理过的12孔细胞培养皿内（细胞数约为5×105cells/well） 细胞培养于37℃、湿度固定、空气成分含百分之五之二氧化 碳（5%CO2/95%Air）培养箱。每两天更换10％FBS之 DMEM/F12之培养液，培养9-12天取用细胞进行实验。 贰、细胞免疫染色（Immunocytochemicalstaining） 透过细胞免疫化学染色法分别鑑定培养之神经细胞与溷 合胶质细胞，以glialfibrillaryacidicprotein（GFAP）之抗体 标示星状胶质细胞，以微小管相关蛋白质-2（microtubule associatedprotein-2，MAP-2）之抗体标示神经细胞，以OX-42 之抗体标示小神经胶细胞。药物实验后，给予4％福马林固定 15 二十分钟，先将样本以PBS清洗二次，目的为洗去固定液， 以0.4％TritonX-100与1％BSA溷和溶入PBS製成的Blocking soluyion处理30分钟，以PBS清洗后分别加入所需之一级抗 体（primaryantibody），包括 anti-MAP-2，存放于4℃反应24小时后以PBS清洗一次，使 用二级抗体（biotinylated immunoglobulins）反应2小时以PBS清洗一次，加入ABC solution反应30分钟，以PBS清洗一次以DAB加5％H2O2 进行呈色反应，并于显微镜下观察神经细胞的型态。 anti-GFAP、anti-OX-42、 anti-rabbit and anti-mouse 参、细胞伤亡测试 一、定性: (1)藉由显微镜观察细胞型态的变化，了解细胞受损的情 况。 (2) A.原理： Trypanblue会直接进入死细胞中而呈色，而活细胞膜完 整且具有选择性通透性，染料无法渗入而不会呈色，由此 可得知细胞存活率，此法又称色素排除法。 Trypanblue染色法: B.步骤： trypanblue（0.4%）与细胞培养液以1:1比例充分溷合， 1ml/well加入培养皿，静置30分钟后以PBS清洗至乾 淨，显微镜检查其染色状况。 二、定量： MTTassay: 16 A.原理： 药物处理过的细胞，其存活率（cellviability）可以MTT 还原法评估。健康细胞可产生较多之能量供细胞代谢粒腺 体内的琥珀酸去氢酶(succinatedehydrogenase)能将MTT 3,(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) bromide)由黄色还原为紫色之formazan结晶颗粒，而还原 力的强弱，即可代表琥珀酸去氢酶之活性，也就是代表代 表细胞之生理状况以及存活率（Manthorpeetal.,1986）。 2,5-diphenyl-tetrzolium B.步骤： 药物实验后，将溶入0.1MPBS之MTT（5mg/ml）经 0.22µmfilter过滤，以1：9之比例加入细胞培养液，置 于培养箱中约 Isopropanol1000µl/well并反覆冲洗以便将结晶之MTT 完全溶解，取其溶解后之液体置入分光光度计中 （SHIMADZU，UV-1601，Japan）以波长570nm测定， MTT反应的量。 另将培养皿置于倒立显微镜下观察型态，藉由观察细胞 型态的变化，瞭解细胞受损的情形。正常健康的神经元细 胞会呈现平滑之椭圆或圆的外型及直径一致，外型平滑的 轴突。死亡的细胞外观呈现细胞膜不完整，细胞萎缩、破 裂以及轴突断裂的现象。 1小时后，将上层液体吸除，加入 第三节、资料之统计与分析 将实际测得之数值平均后，以平均值加减标准误（Mean ±SE）为製作图表之依据。并使用SigmaPlot套装软体，进行 17 重複变数单因子变异数分析（One-wayANOVA）来分析各组 关注页面底部公众号，开通以下权限： 一、获得问题咨询权限。 二、获得工程师维修技术指导。 三、获得软件工程师在线指导 toupview,imageview,OLD-SG等软件技术支持。 四、请使用微信扫描首页底部官方账号！