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载体分子中更好具有两个以上容易检测的标记
所属分类：显微镜百科 点击次数：169 发布日期：2022-06-20
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载体分子中更好具有两个以上容易检测的标记DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其他有意义的DNA片段与能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物使其增殖或进行表达的分子操作过程，因此DNA克隆又称分子克隆、基因操作或重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的使用、体外重组、导人宿主细胞技术和重组子筛选技术等。 一、目的DNA片段的获得 DNA克隆的步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA反转录合成的双链cDNA分子。由于基因组DNA太大，不能够完整克隆，因此必须将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械物理切割和限制性内切核酸酶消化。若基因序列已知而且比较小就可以人工直接化学合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA或cDNA中通过PCR或RT-PCR技术就可以获得目的基因。 二、载体的选择 基因工程的载体应具有一些基本的性质。①在宿主细胞中有独立的复制和表达能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。②分子质量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。③载体分子中更好具有两个以上容易检测的遗传标记(如抗药性标记基因)，以赋予宿主细胞不同的表型特征(如对抗生素的抗性)。④载体本身更好具有尽可能多的限制性内切核酸酶单一切点，为避开外源DNA序列中限制性内切核酸酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点位于检测表型的标记基因之内可造成插人失活效应，则更有利于重组子的筛选。 ， DNA克隆常用的载体有：质粒(plasmid)载体、噬菌体(phage)载体、柯斯质粒(cosmid)载体、单链DNA噬菌体(ssDNA phage)载体、噬粒(phagemid)载体及酵母人工染色体(YAC)等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。
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