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用一种酶酶切然后乙醇沉淀回收DNA分子
所属分类：显微镜百科 点击次数：157 发布日期：2022-06-20
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用一种酶酶切然后乙醇沉淀回收DNA分子 DNA的限制性内切核酸酶剪切与DNA片段的回收 对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相匹配的末端是DNA连接的首要条件。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，只需将限制性内切核酸酶最适的缓冲液、目的DNA和相应的限制性内切核酸酶混合，用灭菌的ddHzO补足体积，在37℃水浴1～3h即可。但对于双酶切，特别是两种酶所用缓冲液成分不同(主要是盐离子浓度不同)或反应温度不同，操作就显得复杂一些，这时可以采用如下措施解决：①先用一种酶酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶酶切；②先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；③使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号效应。 载体及目的DNA片段经酶切后，如果无多余的片段(如载体单切)可以用酚／氯仿抽提后，经乙醇沉淀回收用于连接。但多数还有多余片段，必须电泳分离后回收目的片段。回收既可以采用低熔点胶法和冻融法等经典方法，也可以采用商品化的试剂盒。这些商品化的试剂盒多采用凝胶裂解液(如含有降低熔点的NaI)融化凝胶释放DNA后，采用特殊的硅胶树脂或玻璃奶吸附DNA后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出DNA，具体操作参见产品说明书。这里仅介绍低熔点胶法和冻融法两种经典方法
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