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DNA定序步骤和DNA 的制备-双去氧核醣核酸终止法反应
所属分类：显微镜百科 点击次数：197 发布日期：2022-06-20
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DNA 定序部份变性双股 DNA 的制备取 2g 的双股 DNA ，加去离子水至 18ul 后，加入2l denature solution(2N NaOH and 2mM EDTA) ，至于室温5分钟，加入2l2M ammonium acetate 和75l 70% 酒精，置于冰上 10 分钟。再以10000rpm ，离心 10 分钟，去除上清液。以 70% 酒精清洗一次。真空乾燥之后，以6l 去离子水溶解。第二部份双去氧核醣核酸终止法反应将部份所进行完成的反应，加入2l sequencing primer (5 pmol) 和2l sequencing buffer，置于 37℃ 15 分钟后，加入1l DTT，2ul 1X labelling mixture, 1l(a -35S)dATP 及2l(稀释 1:8)sequenase ，置于室温 5 分钟。 5 分钟后，取 3.5l 分别加至以先预热37℃， 2.5l 的 ddATP ， ddTTP ， ddCTP和ddGTP的管中，均匀混和后，置于 37℃反应5分钟后，各加入4l 的 stop solution 终止反应，置于 -20℃ 保存至凝胶电泳进行时。
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