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原核表达中目的蛋白不明确不知是不是想要的目的条带
所属分类：显微镜百科 点击次数：158 发布日期：2022-07-02
大家好，这里是老上光显微镜知识课堂，在这里你可以学到所有关于显微镜知识，好的，请看下面文章：原核表达中目的蛋白不明确初做蛋白表达，目的片段确定插入载体测序正确，用的BL21为宿主菌，尝试了各种条件，比如IPTG浓度有0.1mM、0.5mM、1mM，温度有37，30，25，蛋白电泳结果分析均无明显目的条带，虽在Marker相近位置处有条带表达，但未诱导前也有该条带的表达，且诱导后条带浓度的增加量并不是十分明显，所以很纠结到底是不是想要的目的条带。
请问各位大虾，碰到这种情况，要怎么办？我的蛋白带了His标签，如果我做镍柱纯化的话可否验证条带的正确性，我怕如果那条条带就算是目的条带的话，表达量太少我一纯化损失太多也看不到，求助我该如何处理？首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确，在此基础上如果没有表达，转其他宿主试试。
已确认外源基因转入载体且测序正确，现在不确定的是外源基因有没有表达，因为条带不明显，像是又不像是目的条带，所以想通过纯化看一下，就是怕本来表达量少再一纯化就没了，也鉴别不了到底是不是要表达的条带了。是不是插入的位点不行，有可能插入的位点不合适造成读码框变化推荐一个方法，你用低浓度咪唑破碎，然后取1毫升上清，加入50微升镍柱胶（挂好镍了的），混合几分钟，然后离心，去上清，留下的胶直接跑电泳，这样微量的表达也能检测出来。这个方法非常的棒！！打算按这种方法试一下，还想请教一下低浓度咪唑破碎液具体成分是什么？做蛋白表达没多久，每次都是直接用PBS洗了再加PBS溶解拿去破碎。还有留下的胶是直接用上样缓冲液混匀跑电泳吧？
再次感谢大虾相助！western blot检测一下就行了……网站网友点击量更高的文献目录排行榜：
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